Replikasi DNA

BAB IV Replikasi DNA

dalam bab ini akan dibahas tiga fungsi DNA sebagai materi genetik pada sebagian besar organisme serta cara replikasi DNA baik pada sistem prokariot maupun eukariot. Dengan mempelajari pokok bahasan ini akan diperoleh gambaran mengenai perbedaan cara replikasi DNA di antara kedua kelompok organisme tersebut.

Setelah mempelajari pokok bahasan di dalam bab ini mahasiswa diharapkan mampu menjelaskan:

1. tiga fungsi DNA sebagai materi genetik,
2. mekanisme replikasi semikonservatif,
3. mekanisme replikasi lingkaran menggulung, pengertian replikon, ori, garpu replikasi, dan termini, cara replikasi DNA pada prokariot, dan cara replikasi DNA pada eukariot.

Pengetahuan awal yang diperlukan oleh mahasiswa agar dapat mempelajari pokok bahasan ini dengan lebih baik adalah struktur asam nukleat, khususnya DNA, dan struktur molekuler kromosom, yang masing-masing telah dijelaskan pada Bab II dan Bab III. Selain itu, konsep dasar tentang replikasi DNA yang telah diperoleh pada mata kuliah Genetika juga sangat mendukung pemahaman materi bahasan di dalam bab ini.

Fungsi DNA sebagai Materi Genetik

DNA sebagai materi genetik pada sebagian besar organisme harus dapat menjalankan tiga macam fungsi pokok berikut ini.

DNA harus mampu menyimpan informasi genetik dan dengan tepat dapat meneruskan informasi tersebut dari tetua kepada keturunannya, dari generasi ke generasi. Fungsi ini merupakan fungsi genotipik, yang dilaksanakan melalui replikasi. Inilah materi yang akan dibahas di dalam bab ini.

DNA harus mengatur perkembangan fenotipe organisme. Artinya, materi genetik harus mengarahkan pertumbuhan dan diferensiasi organisme mulai dari zigot hingga individu dewasa. Fungsi ini merupakan fungsi fenotipik, yang dilaksanakan melalui ekspresi gen (Bab V hingga Bab VII).

DNA sewaktu-waktu harus dapat mengalami perubahan sehingga organisme yang bersangkutan akan mampu beradaptasi dengan kondisi lingkungan yang berubah. Tanpa perubahan semacam ini, evolusi tidak akan pernah berlangsung. Fungsi ini merupakan fungsi evolusioner, yang dilaksanakan melalui peristiwa mutasi (Bab VIII).

Mekanisme Replikasi Semikonservatif

Ada tiga cara teoretis replikasi DNA yang pernah diusulkan, yaitu konservatif, semikonservatif, dan dispersif. Pada replikasi konservatif seluruh tangga berpilin DNA awal tetap dipertahankan dan akan mengarahkan pembentukan tangga berpilin baru. Pada replikasi semikonservatif tangga berpilin mengalami pembukaan terlebih dahulu sehingga kedua untai polinukleotida akan saling terpisah. Namun, masing-masing untai ini tetap dipertahankan dan akan bertindak sebagai cetakan (template) bagi pembentukan untai polinukleotida baru. Sementara itu, pada replikasi dispersif kedua untai polinukleotida mengalami fragmentasi di sejumlah tempat. Kemudian, fragmen-fragmen polinukleotida yang terbentuk akan menjadi cetakan bagi fragmen nukleotida baru sehingga fragmen lama dan baru akan dijumpai berselang-seling di dalam tangga berpilin yang baru. konservatif  semikonservatif  dispersifGambar 4.1. Tiga cara teoretis replikasi DNA
= untai lama = untai baruDi antara ketiga cara replikasi DNA yang diusulkan tersebut, hanya cara semikonservatif yang dapat dibuktikan kebenarannya melalui percobaan yang dikenal dengan nama sentrifugasi seimbang dalam tingkat kerapatan atau equilibrium density-gradient centrifugation. Percobaan ini dilaporkan hasilnya pada tahun 1958 oleh M.S. Meselson dan F.W. Stahl.

Mereka menumbuhkan bakteri Escherichia coli selama beberapa generasi di dalam medium yang mengandung isotop nitrogen 15N untuk menggantikan isotop nitrogen normal 14N yang lebih ringan. Akibatnya, basa-basa nitrogen pada molekul DNA sel-sel bakteri tersebut akan memiliki 15N yang berat. Molekul DNA dengan basa nitrogen yang mengandung 15N mempunyai tingkat kerapatan (berat per satuan volume) yang lebih tinggi daripada DNA normal (14N). Oleh karena molekul-molekul dengan tingkat kerapatan yang berbeda dapat dipisahkan dengan cara sentrifugasi tersebut di atas, maka Meselson dan Stahl dapat mengikuti perubahan tingkat kerapatan DNA sel-sel bakteri E. coli yang semula ditumbuhkan pada medium 15N selama beberapa generasi, kemudian dikembalikan ke medium normal 14N selama beberapa generasi berikutnya.

Molekul DNA mempunyai kerapatan yang lebih kurang sama dengan kerapatan larutan garam yang sangat pekat seperti larutan 6M CsCl (sesium khlorida). Sebagai perbandingan, kerapatan DNA E.coli dengan basa nitrogen yang mengandung isotop 14N dan 15N masing-masing adalah 1,708 g/cm3 dan 1,724 g/cm3, sedangkan kerapatan larutan 6M CsCl adalah 1,700 g/cm3.

Ketika larutan 6M CsCl yang di dalamnya terdapat molekul DNA disentrifugasi dengan kecepatan sangat tinggi, katakanlah 30.000 hingga 50.000 rpm, dalam waktu 48 hingga 72 jam, maka akan terjadi keseimbangan tingkat kerapatan. Hal ini karena molekul-molekul garam tersebut akan mengendap ke dasar tabung sentrifuga akibat adanya gaya sentrifugal, sementara di sisi lain difusi akan menggerakkan molekul-molekul garam kembali ke atas tabung. Molekul DNA dengan tingkat kerapatan tertentu akan menempati kedudukan yang sama dengan kedudukan larutan garam yang tingkat kerapatannya sama dengannya.

medium 15N ekstrak DNA
(generasi 0)

ekstrak DNA
medium 14N (generasi 1)

ekstrak DNA
(generasi 2)
medium 14N

ekstrak DNA
medium 14N (generasi 3)
interpretasi data hasil sentrifugasi DNA

Gambar 4.2. Diagram percobaan Meselson dan Stahl yang memperlihatkan replikasi DNA secara semikonservatifDNA yang diekstrak dari sel E. coli yang ditumbuhkan pada medium 15N terlihat menempati dasar tabung. Selanjutnya, DNA yang diekstrak dari sel E.coli yang pertama kali dipindahkan kembali ke medium 14N terlihat menempati bagian tengah tabung. Pada generasi kedua setelah E.coli ditumbuhkan pada medium 14N ternyata DNAnya menempati bagian tengah dan atas tabung. Ketika E.coli telah ditumbuhkan selama beberapa generasi pada medium 14N, DNAnya nampak makin banyak berada di bagian atas tabung, sedangkan DNA yang berada di bagian tengah tabung tetap. Meselson dan Stahl menjelaskan bahwa pada generasi 15N, atau dianggap sebagai generasi 0, DNAnya mempunyai kerapatan tinggi. Kemudian, pada generasi 14N yang pertama, atau disebut sebagai generasi 1, DNAnya merupakan hibrid antara DNA dengan kerapatan tinggi dan rendah. Pada generasi 2 DNA hibridnya masih ada, tetapi muncul pula DNA baru dengan kerapatan rendah. Demikian seterusnya, DNA hibrid akan tetap jumlahnya, sedangkan DNA baru dengan kerapatan rendah akan makin banyak dijumpai. Pada Gambar 4.2 terlihat bahwa interpretasi data hasil percobaan sentrifugasi ini jelas sejalan dengan cara pembentukan molekul DNA melalui replikasi semikonservatif.

Pada percobaan Meselson dan Stahl ekstrak DNA yang diperoleh dari sel-sel E. coli berada dalam keadaan terfragmentasi sehingga replikasi molekul DNA dalam bentuknya yang utuh sebenarnya belum diketahui. Replikasi DNA kromosom dalam keadaan utuh _ yang pada prokariot ternyata berbentuk melingkar atau sirkular _ baru dapat diamati menggunakan teknik autoradiografi dan mikroskopi elektron. Dengan kedua teknik ini terlihat bahwa DNA berbagai virus, khloroplas, dan mitokhondria melakukan replikasi yang dikenal sebagai replikasi θ (theta) karena autoradiogramnya menghasilkan gambaran seperti huruf Yunani tersebut. Selain replikasi θ, pada sejumlah bakteri dan organisme eukariot dikenal pula replikasi yang dinamakan replikasi lingkaran menggulung (rolling circle replication). Replikasi ini diawali dengan pemotongan ikatan fosfodiester pada daerah tertentu yang menghasilkan ujung 3’ dan ujung 5’. Pembentukan (sintesis) untai DNA baru terjadi dengan penambahan deoksinukleotida pada ujung 3’ yang diikuti oleh pelepasan ujung 5’ dari lingkaran molekul DNA. Sejalan dengan berlangsungnya replikasi di seputar lingkaran DNA, ujung 5’ akan makin terlepas dari lingkaran tersebut sehingga membentuk ’ekor’ yang makin memanjang (Gambar 4.3).

penambahan
nukleotida
ujung 3’
tempat ujung 5’ pelepasan ujung 5’ pemanjangan ’ekor’
terpotongnya ikatan fosfodiester

Gambar 4.3. Replikasi lingkaran menggulung
= untai lama = untai baruReplikon, Ori, Garpu Replikasi, dan Termini

Setiap molekul DNA yang melakukan replikasi sebagai suatu satuan tunggal dinamakan replikon. Dimulainya (inisiasi) replikasi DNA terjadi di suatu tempat tertentu di dalam molekul DNA yang dinamakan titik awal replikasi atau origin of replication (ori). Proses inisiasi ini ditandai oleh saling memisahnya kedua untai DNA, yang masing-masing akan berperan sebagai cetakan bagi pembentukan untai DNA baru sehingga akan diperoleh suatu gambaran yang disebut sebagai garpu replikasi. Biasanya, inisiasi replikasi DNA, baik pada prokariot maupun eukariot, terjadi dua arah (bidireksional). Dalam hal ini dua garpu replikasi akan bergerak melebar dari ori menuju dua arah yang berlawanan hingga tercapai suatu ujung (terminus). Pada eukariot, selain terjadi replikasi dua arah, ori dapat ditemukan di beberapa tempat.

Replikasi pada kedua untai DNA

Proses replikasi DNA yang kita bicarakan di atas sebenarnya barulah proses yang terjadi pada salah satu untai DNA. Untai DNA tersebut sering dinamakan untai pengarah (leading strand). Sintesis DNA baru pada untai pengarah ini berlangsung secara kontinyu dari ujung 5’ ke ujung 3’ atau bergerak di sepanjang untai pengarah dari ujung 3’ ke ujung 5’.

Pada untai DNA pasangannya ternyata juga terjadi sintesis DNA baru dari ujung 5’ ke ujung 3’ atau bergerak di sepanjang untai DNA cetakannya ini dari ujung 3’ ke ujung 5’. Namun, sintesis DNA pada untai yang satu ini tidak berjalan kontinyu sehingga menghasilkan fragmen terputus-putus, yang masing-masing mempunyai arah 5’→ 3’. Terjadinya sintesis DNA yang tidak kontinyu sebenarnya disebabkan oleh sifat enzim DNA polimerase yang hanya dapat menyintesis DNA dari arah 5’ ke 3’ serta ketidakmampuannya untuk melakukan inisiasi sintesis DNA.

Untai DNA yang menjadi cetakan bagi sintesis DNA tidak kontinyu itu disebut untai tertinggal (lagging strand). Sementara itu, fragmen-fragmen DNA yang dihasilkan dari sintesis yang tidak kontinyu dinamakan fragmen Okazaki, sesuai dengan nama penemunya. Fragmen-fragmen Okazaki akan disatukan menjadi sebuah untai DNA yang utuh dengan bantuan enzim DNA ligase.

fragmen-fragmen untai tertinggal
3’ Okazaki 5’
5’ 3’ 5’ 3’
untai pengarah

Gambar 4.4. Diagram replikasi pada kedua untai DNA

Replikasi DNA prokariot

Replikasi DNA kromosom prokariot, khususnya bakteri, sangat berkaitan dengan siklus pertumbuhannya. Daerah ori pada E. coli, misalnya, berisi empat buah tempat pengikatan protein inisiator DnaA, yang masing-masing panjangnya 9 pb. Sintesis protein DnaA ini sejalan dengan laju pertumbuhan bakteri sehingga inisiasi replikasi juga sejalan dengan laju pertumbuhan bakteri. Pada laju pertumbuhan sel yang sangat tinggi, DNA kromosom prokariot dapat mengalami reinisiasi replikasi pada dua ori yang baru terbentuk, sebelum putaran replikasi yang pertama berakhir. Akibatnya, sel-sel hasil pembelahan akan menerima kromosom yang sebagian telah bereplikasi.

Protein DnaA membentuk struktur kompleks yang terdiri atas 30 hingga 40 buah molekul, yang masing-masing akan terikat pada molekul ATP. Daerah ori akan mengelilingi kompleks DnaA-ATP tersebut. Proses ini memerlukan kondisi superkoiling negatif DNA (pilinan kedua untai DNA berbalik arah sehingga terbuka). Superkoiling negatif akan menyebabkan pembukaan tiga sekuens repetitif sepanjang 13 pb yang kaya dengan AT sehingga memungkinkan terjadinya pengikatan protein DnaB, yang merupakan enzim helikase, yaitu enzim yang akan menggunakan energi ATP hasil hidrolisis untuk bergerak di sepanjang kedua untai DNA dan memisahkannya.

Untai DNA tunggal hasil pemisahan oleh helikase selanjutnya diselubungi oleh protein pengikat untai tunggal atau single-stranded binding protein (Ssb) untuk melindungi DNA untai tunggal dari kerusakan fisik dan mencegah renaturasi. Enzim DNA primase kemudian akan menempel pada DNA dan menyintesis RNA primer yang pendek untuk memulai atau menginisiasi sintesis pada untai pengarah.

Agar replikasi dapat terus berjalan menjauhi ori, diperlukan enzim helikase selain DnaB. Hal ini karena pembukaan heliks akan diikuti oleh pembentukan putaran baru berupa superkoiling positif. Superkoiling negatif yang terjadi secara alami ternyata tidak cukup untuk mengimbanginya sehingga diperlukan enzim lain, yaitu topoisomerase tipe II yang disebut dengan DNA girase. Enzim DNA girase ini merupakan target serangan antibiotik sehingga pemberian antibiotik dapat mencegah berlanjutnya replikasi DNA bakteri.

Seperti telah dijelaskan di atas, replikasi DNA terjadi baik pada untai pengarah maupun pada untai tertinggal. Pada untai tertinggal suatu kompleks yang disebut primosom akan menyintesis sejumlah RNA primer dengan interval 1.000 hingga 2.000 basa. Primosom terdiri atas helikase DnaB dan DNA primase.

Primer baik pada untai pengarah maupun pada untai tertinggal akan mengalami elongasi dengan bantuan holoenzim DNA polimerase III. Kompleks multisubunit ini merupakan dimer, separuh akan bekerja pada untai pengarah dan separuh lainnya bekerja pada untai tertinggal. Dengan demikian, sintesis pada kedua untai akan berjalan dengan kecepatan yang sama.

Masing-masing bagian dimer pada kedua untai tersebut terdiri atas subunit a, yang mempunyai fungsi polimerase sesungguhnya, dan subunit e, yang mempunyai fungsi penyuntingan berupa eksonuklease 3’® 5’. Selain itu, terdapat subunit b yang menempelkan polimerase pada DNA.

Begitu primer pada untai tertinggal dielongasi oleh DNA polimerase III, mereka akan segera dibuang dan celah yang ditimbulkan oleh hilangnya primer tersebut diisi oleh DNA polimerase I, yang mempunyai aktivitas polimerase 5’® 3’, eksonuklease 5’ ® 3’, dan eksonuklease penyuntingan 3’ ® 5’. Eksonuklease 5’ ® 3’ membuang primer, sedangkan polimerase akan mengisi celah yang ditimbulkan. Akhirnya, fragmen-fragmen Okazaki akan dipersatukan oleh enzim DNA ligase. Secara in vivo, dimer holoenzim DNA polimerase III dan primosom diyakini membentuk kompleks berukuran besar yang disebut dengan replisom. Dengan adanya replisom sintesis DNA akan berlangsung dengan kecepatan 900 pb tiap detik.

Kedua garpu replikasi akan bertemu kira-kira pada posisi 180°C dari ori. Di sekitar daerah ini terdapat sejumlah terminator yang akan menghentikan gerakan garpu replikasi. Terminator tersebut antara lain berupa produk gen tus, suatu inhibitor bagi helikase DnaB. Ketika replikasi selesai, kedua lingkaran hasil replikasi masih menyatu. Pemisahan dilakukan oleh enzim topoisomerase IV. Masing-masing lingkaran hasil replikasi kemudian disegregasikan ke dalam kedua sel hasil pembelahan.

Replikasi DNA eukariot

Pada eukariot replikasi DNA hanya terjadi pada fase S di dalam interfase. Untuk memasuki fase S diperlukan regulasi oleh sistem protein kompleks yang disebut siklin dan kinase tergantung siklin atau cyclin-dependent protein kinases (CDKs), yang berturut-turut akan diaktivasi oleh sinyal pertumbuhan yang mencapai permukaan sel. Beberapa CDKs akan melakukan fosforilasi dan mengaktifkan protein-protein yang diperlukan untuk inisiasi pada masing-masing ori.

Berhubung dengan kompleksitas struktur kromatin, garpu replikasi pada eukariot bergerak hanya dengan kecepatan 50 pb tiap detik. Sebelum melakukan penyalinan, DNA harus dilepaskan dari nukleosom pada garpu replikasi sehingga gerakan garpu replikasi akan diperlambat menjadi sekitar 50 pb tiap detik. Dengan kecepatan seperti ini diperlukan waktu sekitar 30 hari untuk menyalin molekul DNA kromosom pada kebanyakan mamalia.
Sederetan sekuens tandem yang terdiri atas 20 hingga 50 replikon mengalami inisiasi secara serempak pada waktu tertentu selama fase S. Deretan yang mengalami inisasi paling awal adalah eukomatin, sedangkan deretan yang agak lambat adalah heterokromatin. DNA sentromir dan telomir bereplikasi paling lambat. Pola semacam ini mencerminkan aksesibilitas struktur kromatin yang berbeda-beda terhadap faktor inisiasi.
Seperti halnya pada prokariot, satu atau beberapa DNA helikase dan Ssb yang disebut dengan protein replikasi A atau replication protein A (RP-A) diperlukan untuk memisahkan kedua untai DNA. Selanjutnya, tiga DNA polimerase yang berbeda terlibat dalam elongasi. Untai pengarah dan masing-masing fragmen untai tertinggal diinisiasi oleh RNA primer dengan bantuan aktivitas primase yang merupakan bagian integral enzim DNA polimerase a. Enzim ini akan meneruskan elongasi replikasi tetapi kemudian segera digantikan oleh DNA polimerase d pada untai pengarah dan DNA polimerase e pada untai tertinggal. Baik DNA polimerase d maupun e mempunyai fungsi penyuntingan. Kemampuan DNA polimerase d untuk menyintesis DNA yang panjang disebabkan oleh adanya antigen perbanyakan nuklear sel atau proliferating cell nuclear antigen (PCNA), yang fungsinya setara dengan subunit b holoenzim DNA polimerase III pada E. coli. Selain terjadi penggandaan DNA, kandungan histon di dalam sel juga mengalami penggandaan selama fase S.

Mesin replikasi yang terdiri atas semua enzim dan DNA yang berkaitan dengan garpu replikasi akan diimobilisasi di dalam matriks nuklear. Mesin-mesin tersebut dapat divisualisasikan menggunakan mikroskop dengan melabeli DNA yang sedang bereplikasi. Pelabelan dilakukan menggunakan analog timidin, yaitu bromodeoksiuridin (BUdR), dan visualisasi DNA yang dilabeli tersebut dilakukan dengan imunofloresensi menggunakan antibodi yang mengenali BUdR.

Ujung kromosom linier tidak dapat direplikasi sepenuhnya karena tidak ada DNA yang dapat menggantikan RNA primer yang dibuang dari ujung 5’ untai tertinggal. Dengan demikian, informasi genetik dapat hilang dari DNA. Untuk mengatasi hal ini, ujung kromosom eukariot (telomir) mengandung beratus-ratus sekuens repetitif sederhana yang tidak berisi informasi genetik dengan ujung 3’ melampaui ujung 5’. Enzim telomerase mengandung molekul RNA pendek, yang sebagian sekuensnya komplementer dengan sekuens repetitif tersebut. RNA ini akan bertindak sebagai cetakan (templat) bagi penambahan sekuens repetitif pada ujung 3’.

Hal yang menarik adalah bahwa aktivitas telomerase mengalami penekanan di dalam sel-sel somatis pada organisme multiseluler, yang lambat laun akan menyebabkan pemendekan kromosom pada tiap generasi sel. Ketika pemendekan mencapai DNA yang membawa informasi genetik, sel-sel akan menjadi layu dan mati. Fenomena ini diduga sangat penting di dalam proses penuaan sel. Selain itu, kemampuan penggandaan yang tidak terkendali pada kebanyakan sel kanker juga berkaitan dengan reaktivasi enzim telomerase.